Un microscope à fluorescence est un type de microscope optique qui utilise une source de lumière de haute intensité pour éclairer l'échantillon et exciter les fluorochromes présents dans l'échantillon. L’éclairage de l’échantillon se fait généralement avec une source lumineuse émettant de la lumière ultraviolette. Ils sont largement utilisés dans les domaines biologique, médical et industriel.
Comment fonctionne un microscope à fluorescence ?
Un microscope à fluorescence utilise une lampe au mercure ou au xénon pour produire de la lumière ultraviolette. La lumière entre dans le microscope et frappe un miroir dichroïque – un miroir qui reflète une gamme de longueurs d’onde et laisse passer une autre gamme. Le miroir dichroïque réfléchit la lumière ultraviolette jusqu'à l'échantillon. Certains spécimens sont naturellement fluorescents sous la lumière ultraviolette car ils contiennent des substances fluorescentes telles que la chlorophylle. Si l’échantillon à visualiser n’est pas naturellement fluorescent, il peut être coloré avec des colorants fluorescents appelés fluorochromes.
De quoi est composé un microscope à fluorescence ?
1. Source de lumière
Les sources lumineuses les plus courantes sont le mercure, le xénon et les LED. Mercure fournit la meilleure qualité de lumière pour le microscope à fluorescence. Les LED sont de plus en plus populaires car elles sont moins chères que les autres sources et consomment moins d’énergie.
| Lampe à Mercure | Lampe au xénon | DIRIGÉ | |
| Longueur d'onde de la lumière émise | 350-370 nm | 400 nm ~ 450 nm | 400-700 nm |
| Durée de vie (heure) | 200-300 | 400-600 | 10000 |
| Avantage | 1. Lumière à haute intensité, les sources lumineuses les plus courantes. 2. Il émet de forts ultraviolets et bleu-violet pour exciter toutes sortes de fluorophores. 3. Images lumineuses et colorées. | 1. L'intensité spectrale est stable. 2. Forte intensité spectrale dans l’infrarouge et l’infrarouge moyen. | 1. Facile à remplacer. 2. Pas besoin de s'échauffer. 3. Peut être allumé et éteint instantanément. 4. Contrôlez l’intensité de la source lumineuse. |
| Inconvénient | 1. Une courte vie. 2. Long temps de préchauffage. | 1. Un boîtier d'alimentation CC basse tension spécial est requis en cas de chaleur excessive. 2. Plus chère que la lampe au mercure | 1. La lumière UV est plus faible que la lampe au mercure. 2. Chaque longueur d'onde de lumière nécessite une LED séparée en raison des bandes passantes étroites qu'elles émettent. |
Fixation fluorescente au mercure
Fixation fluorescente LED
2. Filtre d'excitation
Le filtre d'excitation est indispensable au fonctionnement d'un microscope à fluorescence. Il laisse passer la lumière d'une longueur d'onde plus courte, que le colorant fluorescent pourrait absorber. En outre, il bloque les autres sources de lumière excitante.
Filtre d'excitation (B, G, U, V)
3. Miroir dichroïque
Le miroir dichroïque est un type de filtre optique qui reflète la lumière à certaines longueurs d'onde tout en en transmettant d'autres. Il est utilisé dans les microscopes à fluorescence pour séparer les longueurs d'onde d'excitation et d'émission.
4. Filtre d'émission
Le filtre d'émission laisse passer uniquement les longueurs d'onde émises par le fluorophore et bloque toute lumière indésirable en dehors de cette bande, notamment les longueurs d'onde d'excitation.
5. Colorants fluorescents
Les colorants fluorescents sont des composés organiques qui possèdent une propriété de fluorescence, grâce à laquelle ils peuvent former une image fluorescente en émettant une lumière verte visible à contraste élevé après avoir été excités par la lumière ultraviolette hautement éclairante. Les colorants fluorescents couramment utilisés sont : DAPI (49,6-diamidino-2-phénylindole), orange d'acridine, auramine-rhodamine, Alexa Fluors ou DyLight 488.
Combien de types de microscopes à fluorescence ?
1. Microscope droit à épifluorescence :
C'est le type de microscope à fluorescence le plus courant. L'excitation du fluorophore et la détection de la fluorescence se font par le même trajet lumineux (c'est à dire à travers l'objectif). La majorité des microscopes à fluorescence, en particulier ceux utilisés dans les sciences de la vie, sont de conception à épifluorescence.
Microscope biologique fluorescent de recherche BS-2081F
2. Microscope confocal à fluorescence :
Microscope confocal à fluorescence : Ce type de microscope à fluorescence combine le balayage laser avec un éclairage fluorescent pour produire une image. Il peut être utilisé dans un large éventail d'applications, telles que l'étude des cellules et des tissus, la détection de protéines et d'autres substances dans les cellules et la mesure de l'épaisseur des matériaux.
Microscope biologique fluorescent de recherche BS-2081F
3. Microscope à fluorescence inversée
La source de lumière et le condenseur de ce type de microscope sont situés sur le dessus, face vers le bas. L'angle d'éclairage doit être de 90 degrés par rapport à la surface de l'échantillon examiné.
Microscope fluorescent inversé BS-2095F
Quels sont les avantages et les inconvénients des microscopes à fluorescence ?
Avantages :
- Permet l'observation des cellules des organismes vivants sans les endommager
- Fournit des images haute résolution avec des couleurs précises
- Permet l'étude des processus vivants dans les cellules
- Être utilisé pour identifier différents types de molécules à l'intérieur des cellules, telles que des protéines ou des acides nucléiques.
Inconvénients :
-Il permet uniquement l'observation de structures spécifiques à l'intérieur d'une cellule marquée avec le colorant fluorescent.
-Le photoblanchiment dû à l'excitation électronique pendant le processus de fluorescence peut affecter les molécules réactives des colorants fluorescents. En conséquence, les colorants réactifs pourraient perdre leur propriété chimique d’intensité d’émission de fluorescence.
-Les cellules sont sensibles à l'effet phototoxique après coloration avec des colorants fluorescents, car les molécules fluorophores absorbent les photons à haute énergie de la lumière à courte longueur d'onde.
Quelles sont les applications d’un microscope à fluorescence ?
Les microscopes à fluorescence sont largement utilisés dans divers domaines de recherche et d'application, notamment la biochimie, la biologie cellulaire, la microbiologie, l'immunologie et la médecine.
1. Dans le domaine de la biologie, le microscope à fluorescence permet une identification précise et détaillée des composants et activités cellulaires et submicroscopiques à l'aide du marquage par colorant fluorescent.
2. Dans le domaine médical, le microscope à fluorescence peut utiliser des réactifs fluorescents pour détecter la présence et la distribution de bactéries et de virus, ou pour aider à marquer des cibles chirurgicales afin de faciliter la chirurgie.
3. Dans le domaine de la minéralogie, le microscope à fluorescence est souvent utilisé pour étudier des substances ayant des propriétés de fluorescence spontanée, telles que l'asphalte, le pétrole, le charbon, l'oxyde de graphène et d'autres minéraux.
4. En science des matériaux, le microscope à fluorescence peut être utilisé dans l'industrie textile ou l'industrie papetière pour analyser des matériaux à base de fibres.
Heure de publication : 14 mars 2023