Un filtre à fluorescence est un composant essentiel du microscope à fluorescence. Un système typique comporte trois filtres de base : un filtre d'excitation, un filtre d'émission et un miroir dichroïque. Ils sont généralement emballés dans un cube afin que le groupe soit inséré ensemble dans le microscope.
Comment fonctionne un filtre fluorescent ?
Filtre d'excitation
Les filtres d'excitation transmettent la lumière d'une longueur d'onde spécifique et bloquent les autres longueurs d'onde. Ils peuvent être utilisés pour produire différentes couleurs en réglant le filtre pour ne laisser passer qu’une seule couleur. Les filtres d'excitation sont de deux types principaux : les filtres passe-long et les filtres passe-bande. L'excitateur est généralement un filtre passe-bande qui laisse passer uniquement les longueurs d'onde absorbées par le fluorophore, minimisant ainsi l'excitation d'autres sources de fluorescence et bloquant la lumière d'excitation dans la bande d'émission de fluorescence. Comme le montre la ligne bleue sur la figure, la BP est comprise entre 460 et 495, ce qui signifie qu'elle ne peut traverser que la fluorescence de 460 à 495 nm.
Il est placé dans le trajet d'éclairage d'un microscope à fluorescence et filtre toutes les longueurs d'onde de la source lumineuse à l'exception de la plage d'excitation du fluorophore. La transmission minimale du filtre dicte la luminosité et la brillance des images. Un minimum de 40 % de transmission pour tout filtre d'excitation est recommandé, de sorte que la transmission soit idéalement > 85 %. La bande passante du filtre d'excitation doit être entièrement comprise dans la plage d'excitation du fluorophore, de sorte que la longueur d'onde centrale (CWL) du filtre soit aussi proche que possible de la longueur d'onde d'excitation maximale du fluorophore. La densité optique (OD) du filtre d'excitation dicte l'obscurité de l'image d'arrière-plan ; La DO est une mesure de la capacité d'un filtre à bloquer les longueurs d'onde en dehors de la plage de transmission ou de la bande passante. Une DO minimale de 3,0 est recommandée, mais une DO de 6,0 ou plus est idéale.
Filtre d'émission
Les filtres d'émission ont pour objectif de permettre à la fluorescence souhaitée de l'échantillon d'atteindre le détecteur. Ils bloquent les longueurs d'onde plus courtes et ont une transmission élevée pour les longueurs d'onde plus longues. Le type de filtre est également associé à un numéro, par exemple BA510IF sur la figure (filtre barrière contre les interférences), cette désignation fait référence à la longueur d'onde à 50 % de sa transmission maximale.
Les mêmes recommandations pour les filtres d'excitation s'appliquent aux filtres d'émission : transmission minimale, bande passante, OD et CWL. Un filtre d'émission avec la combinaison idéale CWL, transmission minimale et OD fournit les images les plus lumineuses possibles, avec le blocage le plus profond possible, et assure la détection des signaux d'émission les plus faibles.
Miroir dichroïque
Le miroir dichroïque est placé entre le filtre d'excitation et le filtre d'émission selon un angle de 45° et réfléchit le signal d'excitation vers le fluorophore tout en transmettant le signal d'émission vers le détecteur. Les filtres dichroïques et séparateurs de faisceau idéaux présentent des transitions nettes entre la réflexion maximale et la transmission maximale, avec une réflexion >95 % pour la bande passante du filtre d'excitation et une transmission >90 % pour la bande passante du filtre d'émission. Sélectionnez le filtre en tenant compte de la longueur d’onde d’intersection (λ) du fluorophore, afin de minimiser la lumière parasite et de maximiser le rapport signal/bruit de l’image fluorescente.
Le miroir dichroïque sur cette figure est le DM505, ainsi nommé car 505 nanomètres est la longueur d'onde à 50 % de la transmission maximale de ce miroir. La courbe de transmission de ce miroir montre une transmission élevée au-dessus de 505 nm, une forte baisse de transmission à gauche de 505 nanomètres et une réflectivité maximale à gauche de 505 nanomètres, mais peut néanmoins avoir une certaine transmission en dessous de 505 nm.
Quelle est la différence entre les filtres passe-long et passe-bande ?
Les filtres de fluorescence peuvent être divisés en deux types : passe-long (LP) et passe-bande (BP).
Les filtres passe-long transmettent les longues longueurs d’onde et bloquent les plus courtes. La longueur d'onde de coupure est la valeur à 50 % de la transmission maximale, et toutes les longueurs d'onde au-dessus de la coupure sont transmises par les filtres passe-long. Ils sont fréquemment utilisés dans les miroirs dichroïques et les filtres d'émission. Les filtres passe-haut doivent être utilisés lorsque l'application nécessite une collecte maximale des émissions et lorsque la discrimination spectrale n'est pas souhaitable ou nécessaire, ce qui est généralement le cas pour les sondes qui génèrent une seule espèce émettrice dans des échantillons présentant des niveaux d'autofluorescence de fond relativement faibles.
Les filtres passe-bande ne transmettent qu’une certaine bande de longueur d’onde et en bloquent d’autres. Ils réduisent la diaphonie en permettant uniquement la transmission de la partie la plus forte du spectre d'émission des fluorophores, réduisent le bruit d'autofluorescence et améliorent ainsi le rapport signal/bruit dans les échantillons d'autofluorescence de fond élevé, ce que les filtres passe-long ne peuvent pas offrir.
Combien de types de jeux de filtres fluorescents BestScope peut fournir ?
Certains types courants de filtres incluent les filtres bleus, verts et ultraviolets. Comme indiqué dans le tableau.
| Ensemble de filtres | Filtre d'excitation | Miroir dichroïque | Filtre barrière | Longueur d'onde de la lampe LED | Application |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485 nm | ·FITC : méthode des anticorps fluorescents ·Acidine orange : ADN, ARN ·Auramine : bacille tuberculeux ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | DM570 | BA575 | 535 nm | ·Rhodamine, TRITC : Méthode des anticorps fluorescents ·Iodure de propidium : ADN · Appel d'offres |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365 nm | ·Observation en auto-fluorescence ·DAPI : coloration de l'ADN ·Hoechest 332528, 33342 : utilisé pour la coloration des chromosomes |
| V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405 nm | ·Catécholamines ·5-hydroxy tryptamine ·Tétracycline : squelette, dents |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640 nm | ·Cy5 ·Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647 |
Les ensembles de filtres utilisés dans les acquisitions de fluorescence sont conçus autour des principales longueurs d'onde utilisées dans les applications de fluorescence, basées sur les fluorophores les plus utilisés. Pour cette raison, ils portent également le nom du fluorophore auquel ils sont destinés à l'imagerie, comme les cubes filtrants DAPI (bleu), FITC (vert) ou TRITC (rouge).
| Ensemble de filtres | Filtre d'excitation | Miroir dichroïque | Filtre barrière | Longueur d'onde de la lampe LED |
| FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485 nm |
| DAPI | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365 nm |
| TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535 nm |
| FL-Auramine | BP470 | DM480 | BA485 | 450 nm |
| Rouge Texas | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560 nm |
| mCherry | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560 nm |
Comment choisir un filtre fluorescent ?
1. Le principe de sélection du filtre à fluorescence est de laisser la lumière de fluorescence/émission passer autant que possible à travers l'extrémité d'imagerie et de bloquer complètement la lumière d'excitation en même temps, de manière à obtenir le rapport signal/bruit le plus élevé. En particulier pour l'application de l'excitation multiphotonique et du microscope à réflexion interne totale, le faible bruit provoquera également de grandes interférences avec l'effet d'imagerie, de sorte que l'exigence d'un rapport signal/bruit est plus élevée.
2. Connaître le spectre d'excitation et d'émission du fluorophore. Pour construire un ensemble de filtres de fluorescence qui génère une image de haute qualité et à contraste élevé avec un fond noir, les filtres d'excitation et d'émission doivent atteindre une transmission élevée avec une ondulation de bande passante minimale sur les régions qui correspondent aux pics ou aux émissions d'excitation du fluorophore.
3. Tenez compte de la durabilité des filtres fluorescents. Ces filtres doivent être imperméables aux sources de lumière intenses qui génèrent une lumière ultraviolette (UV) pouvant entraîner un « épuisement professionnel », en particulier du filtre excitateur car il est soumis à toute l'intensité de la source d'éclairage.
Les différents exemples d’images fluorescentes
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Heure de publication : 09 décembre 2022